酵素工学ニュース　第69号　pp.31-35（2013）

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１．はじめに
抗体は特定の抗原を特異的に認識する分子として、ELISA法による抗原の定量や、免疫染色法による抗原の検出等、研究用・臨床検査用試薬として広く利用されている。近年では、そうした利用法に加え、抗体を医薬品として生体内に投与する抗体医薬としての利用方法が非常に注目されている。抗体を医薬品として利用する為には、不純物混入による副作用を回避するために、高純度に精製する必要がある。また、医薬品として、安定的に大量生産する必要もあるため、モノクローナル抗体が利用されている。従来モノクローナル抗体は、抗原を各種動物に免疫し、生体から抗体産生細胞を分離・調製し、目的に応じた手法で選別して取得する。現在では、あらかじめ構築した抗体ライブラリーからスクリーニングして取得する手法も利用されている1,2)。

免疫する抗原としては、抗原タンパク質を発現する細胞、抗原タンパク質や、低分子量ペプチド・化合物を結合したキャリアータンパク質、抗原タンパク質をコードするcDNA3)等、各種抗原が利用可能である。抗原の免疫方法としては、生体への直接免疫以外に、体外免疫法4)が提案されている。体外免疫法の特徴は、
・抗原量が少なくて済む
・時間や手間がかからない
・免疫動物に対して毒性のある物質でも免疫できる可能性がある
という点が挙げられる。

筆者らのグループでは、体外免疫法を利用した、高効率な試験管内免疫法を開発し、ニワトリ卵白リゾチームに対する高親和性抗体の取得に成功している5)。本稿では、筆者らの用いた体外免疫法の改良点とその効果、得られた抗体の性能について最近の知見を紹介する。

２．体外免疫法の原理と改良
体外免疫法は、生体内で発生している免疫反応を試験管内で再構成する手法である。生体内では抗原により刺激されたB細胞に対して、ヘルパーT細胞が相互作用し、抗体の親和性成熟などの免疫反応が誘導される。このため、体外免疫法は、抗原を感作したB細胞に対して、T細胞性の刺激を加えて、試験管内で免疫反応を誘導する手法と言える。

これまでの研究では、�@T細胞が多く含まれる胸腺細胞を培養し、その培養液でB細胞を活性化する手法6)、�A抗原で活性化したT細胞と共培養する手法7)、�Bサイトカインや抗体を添加して、B細胞に刺激を加える手法8)などが提案されている。筆者らは、再現性良く実験が行え、反応をトレースしやすい�Bの方法を採用した (図1)。

筆者らは、親和性の高い抗体を取得するために、抗体の親和性成熟を誘導する必要性に着目した。生体内での抗体の親和性成熟に関する研究は、体外免疫法が提案された1980年前後から比べても非常に進展しており、当時は明らかとなっていなかった事象が数多く報告されている。脾臓内でT細胞と相互作用したB細胞は、胚中心 (Germinal Center, GC) を形成する。GCにおいてB細胞は6-12時間という非常に短い倍加時間で増殖し、1回の細胞分裂ごとに抗体の可変領域をコードする遺伝子に1ヵ所の変異が入ると推定されている9)。この遺伝子変異は、体細胞変異と呼ばれ、Activation Induced Cytidine Deaminase (AID) が関与していることが明らかとなっている10)。これらのことから、筆者らは、試験管内でGCの形成を誘導し、かつ、AIDの発現により抗体遺伝子の体細胞変異を誘導することによって、抗体の親和性を変化させ得る体外免疫方法となると考えた。

これまでの体外免疫法では、B細胞とT細胞の相互作用において重要な働きをするCD40分子11)や、B細胞をポリクローナルに活性化する因子としてLipopolysaccharide (LPS) が広く用いられている12)。筆者らはこれらの因子に加えて、AIDの発現を誘導するIL-4、IL-5、anti-CD38抗体13)を加えて、高効率な試験管内免疫方法を確立するに至った。

筆者らの実施した体外免疫法のの概要を図2に示す。4-6週齢の雌のBALB/cマウスから脾臓細胞を取得し、1x107cells/mLにRPMI培地を用いて調製し、体外免疫に使用した。この細胞1 mLに1 nmolのニワトリ卵白リゾチーム (Hen Egg Lysozyme, HEL) を添加し、室温で15分間感作させた。ここに刺激物質としてIL-4、IL-5 (各50 ng/mL)、anti-CD40抗体、anti-CD38抗体 (各5μg/mL)、LPS (200μg/mL) を添加し、40%FBSを含むRPMI培地で5倍希釈し、数日間培養し、体外免疫された細胞を取得した。

３．AIDの発現誘導
前述のサイトカイン類を分類すると、T細胞性の刺激因子として、IL-4、IL-5、anti-CD38抗体、anti-CD40抗体の4種、T細胞非依存性の刺激物質としてLPSが挙げられる。まずは、T細胞性の刺激因子の効果を調べる為に、各サイトカインの組み合わせ刺激によるAID の発現量をReal-Time PCR法で定量した (図3)。抗原刺激、サイトカイン類による刺激を共に加えなかった場合に比べて、様々な刺激条件でAIDの発現が誘導されていた。しかし、抗原刺激による優位な発現量上昇が認められており、かつ無刺激よりも発現量が上昇していたサイトカイン類の組み合わせは、IL-4、IL-5、anti-CD38抗体、anti-CD40抗体の組み合わせであった。この刺激によってAIDの発現量は、体外免疫前の64倍 (抗原を添加しなかった場合の1.7倍) に上昇した (この組み合わせを以下T cell Dependent Stimuli (TDS) と略す)。

また、LPSで刺激することで、体外免疫前の300倍を超えるAID発現誘導が観察されたが、LPS単独刺激の場合は抗原刺激の有無で優位な差異は認められなかった。しかし、LPSとTDSで共刺激した場合には、抗原刺激の有無で発現量に優位な差異が認められ、抗原刺激により高いAID発現量が誘導された。

４．GCの形成誘導
次に、LPSとTDSの共刺激でGCの形成が誘導されているかを、Flowcytometryにより検討した。マウスのGC B細胞は、表面抗原としてCD38の発現量が減少すること14)や、B細胞のマーカーであるCD45Rの発現が認められることが報告されており15)、これらの表面抗原の発現量を指標として、GC B細胞様のphenotypeを示すGC-like B cell、GC-like B cellに分化途中と考えられるPre GC-like B cell、さらに、GC B細胞からPlasmaBlast (PB) に分化途中と考えられるPre-PB like B cellの細胞数を調べた (図4)。その結果、抗原刺激のない場合に比べて多くのGC-Like B cellが検出され、LPSとTDSの共刺激によって試験管内でGCの形成が誘導されることが示唆された。

５．体細胞変異の誘導
前述の通り、GCの形成と、AIDの発現が誘導できる体外免疫法を確立した。この手法を用いることで、体細胞変異が抗体遺伝子に蓄積されることが予想されたので、抗体遺伝子への変異の蓄積を以下の方法で確認した。体外免疫後の細胞から抗体遺伝子をPCR法で抽出し、一本鎖抗体 (scFv) のライブラリを構築した。抗原を固相化したELISA plateを用いて、親和性のあるクローンを選択した。得られたクローンの約30％で抗原に対して親和性のあるクローンであった。親和性のあったクローンのうち、ELISA法での測定値の高いクローンを複数選択し、その遺伝子配列を決定した。得られた遺伝子配列を、公開されている抗体遺伝子と比較し、点変異の個数・頻度を確認した (表1)。

体外免疫後の培養日数4日目〜7日目まで解析したところ、5日目以降は2％以上の頻度で変異が蓄積されており、自然突然変異よりも高頻度に遺伝子変異が蓄積されていた16)。培養日数を経るごとに変異の個数・頻度は上昇することが予想されたが、今回の結果では、約2％前後で安定していた。この結果は、今回検討したクローンが、抗原に対して親和性のあるクローンを用いた為であると考えられた。

また、抗体蛋白質の超可変領域 (CDR) のアミノ酸配列を解析すると、得られたクローンが、非常に多様なバリエーションを有していることが示された (表2)。

６．高親和性抗体の取得
これまで述べた通り、抗体遺伝子に変異を蓄積することができる体外免疫法を確立した。この体外免疫法によって免疫したマウス脾臓細胞をハイブリドーマ化し、モノクローナル抗体を取得した。得られたクローンの親和性をBIACOREによって測定した結果、高親和性抗体 (KD: 0.5 nM, kon: 9.9 x 105M-1s-1, koff: 5.5 x 10-4s-1) を示すクローンを得ることに成功した (図5)。

７．おわりに
筆者らは、これまでに提案されていた体外免疫法に、最新の免疫研究、特に抗体の親和性成熟の情報を取り入れ、生体外で抗体遺伝子に変異を蓄積する事の出来る免疫方法を確立した。この試験管内免疫方法を用いて、高親和性抗体を得ることにも成功した。また、今回の結果では、得られたクローンの約30％という非常に高い効率で抗原に対して親和性のあるクローンが得られており、高効率な試験管内免疫方法を確立するに至った。

生体内の抗体の親和性成熟では、体細胞変異によるクローンの拡大と樹状細胞との相互作用による高親和性抗体を発現する細胞の選択的増殖が起こっている。後者の樹状細胞とB細胞の相互作用を試験管内で再現することで、さらに利用価値の高い抗体取得方法となると考えている。

文献
1) Seo, H., Masuoka, M., Murofushi, H., Takeda, S., Shibata, T., Ohta, K.: Nat. Biotechnol., 23, 731 (2005).
2) Knappik, A., Ge, L., Honegger, A., Pack, P., Fischer, M., Wellnhofer, G., Hoess, A., Wolle, J., Pluckthun, A., Virnekas, B.: J. Mol. Biol., 296, 57 (2000).
3) 小林岳史: 生物工学, 86, 384 (2008).
4) Borrebaeck, C. A., Moller, S. A.: J. Immunol., 136, 3710 (1986).
5) Inagaki, T., Yoshimi, T., Kobayashi, S., Kawahara, M., Nagamune, T.: J. Biosci. Bioeng., 115, 339 (2013).
6) Luben, R. A., Mohler, M. A.: Mol. Immunol., 17, 635 (1980).
7) Uthoff, S., Boldicke, T.: J. Immunol. Methods, 166, 165 (1993).
8) Strike, L. E., Devens, B. H., Lundak, R. L.: J. Immunol., 132, 1798 (1984).
9) Michael, M.-H.: Trends in Immunology, 30, 157 (2009).
10) Martin, A., Bardwell, P. D., Woo, C. J., Fan, M., Shulman, M. J., Scharff, M. D.: Nature, 415, 802 (2002).
11) Parker, D. C.: Annu. Rev. Immunol., 11, 331 (1993).
12) Pasare, C., Medzhitov, R.: Nature, 438, 364 (2005).
13) Horikawa, K., Takatsu, K.: Immunology, 118, 497 (2006).
14) Shinall, S. M., Gonzalez-Fernandez, M., Noelle, R. J., Waldschmidt, T. J.: J. Immunol., 164, 5729 (2000).
15) Richard, R. H., Hayakawa, K.: Annual Review of Immunology, 19, 595 (2001).
16) Messmer, B. T., Albesiano, E., Messmer, D., Chiorazzi, N.: Blood, 103, 3490 (2004).

　

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