酵素工学ニュース　第71号　pp.12-17（2014）

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１．はじめに
EQCM (Electrochemical Quartz Crystal Microbalance) 測定とは、電気化学測定と水晶振動子マイクロバランス法 (QCM法) との同時測定法である1)。電気化学測定は電極表面での分子の酸化還元の測定である。一方、QCM法は電極表面の重量の計測法であり、分子の電極表面への吸着および脱離などを定量する。したがって、これらを同時に測定することにより、分子の酸化還元反応が進行する際の挙動をリアルタイムで計測することが可能となる。さらに、EQCM測定を高感度化することにより、酵素反応等の生体反応を解析することができる。酵素と基質との反応において、電極上に固定化した基質の酸化還元反応と同時に酵素-基質複合体の形成速度を調べることが可能となり、これまで、溶液の反応速度論では測定できない反応メカニズムを明らかにできる。

電子移動と関係した酵素反応は、ミトコンドリアの電子伝達系、光合成のPSI、PSII等でみられる。ミトコンドリアの内部では、タンパク質間電子移動反応の連鎖が進行しており、電子移動の際のポテンシャルエネルギーを生体エネルギー (ATP、NADHなど) に変換している。それぞれのタンパク質の酸化還元中心は鉄硫黄クラスターやヘムなどの補欠分子族である。

高感度EQCM測定は、これらの電子移動と生体反応の密接な関連性を明らかにすると共に素反応のメカニズムを解析するための有効な手法である。

２．タンパク質の電気化学と高感度EQCM測定
タンパク質の電子移動の研究は、電気化学測定を利用した研究成果が多く、有効な手法の一つである。しかし、タンパク質の電気化学測定は今のところ容易であるとは言いがたい。タンパク質の測定においては、測定条件が限られてしまうこと (水溶液中であること、中性付近のpH条件、温度条件など)、また、タンパク質の酸化還元中心である補欠分子族はタンパク質内部に存在するので、必ずしも電極と電子の受け渡しができないといった問題がある。さらに、電極表面への吸着によりタンパク質が変性することも多い。これまでに、金電極表面の機能化、炭素電極を用いたプロテインフィルム法など、さまざまな工夫によりタンパク質の電気化学測定法は進化しており、多くのタンパク質の電子移動について調べることが出来るようになってきた2-6)。

図1にEQCM測定装置の概略を示す。電気化学測定の作用電極を水晶振動子の金表面とし、測定試料溶液と接触させる。水晶振動子の振動数を計測しながら、作用電極電位を変化させるために、作用電極にはポテンシオスタットと周波数カウンターの両方が接続される。これにより、ボルタモグラムと振動数変化を同時に測定できる。振動数を重量換算すると、基本振動数9 MHzの水晶振動子において振動数1 Hzの減少が約1.4 ngの重量増加に相当する。

しかし、水溶液中でのEQCM測定では、感度が低く、10 ng程度の変化を測定するのが限界であり、100 ngから数µgの変化が有意な測定であるとされてきた。したがって、酸化還元により重合したポリマーの重量の測定や、酸化還元による金属化合物の析出や吸着の解析等に利用されてきた7,8)。

これまで、タンパク質の測定への応用がなされなかったのは、上に述べた感度の低さが問題であった。そこで、高感度化を行い、タンパク質の測定に応用した。高感度化は、電場と磁場の振動ノイズの除去によって達成された。水晶振動子の振動により生じる振動磁場とオシレーターの共振回路が発する振動磁場との干渉を最小限にするために、それぞれ独立にシールドし、ノイズの低減を図った。この結果、数百倍も感度が向上し、0.01 Hzレベルの変化を測定することが可能となった。これにより、タンパク質のEQCM測定が可能となり、これまで見ることのできなかった現象を解析できるようになった。

３．高感度EQCM測定によるシトクロムc3の電子移動機能の解明
3-1　律速段階となる電子供与のメカニズム
タンパク質間の電子移動の特徴は決まった相手から電子を受容し、決まった相手に電子供与することである。言い換えると、秩序ある電子移動が行われることである。これに関して、これまでに直接明らかとなっていない。ただし、いくつかの酸化還元タンパク質では、電子を受け取ると、一定時間電子供与できない不明な時間が存在することが実験的に明らかにされている。この時間が分子間電子移動の律速段階となることが分かっている。すなわち、電子を受容すると一定時間電子を保有し、電子供与しないのであろうと考えられている。

これまでに、[3Fe-4S]クラスターを有するフェレドキシンにおいて、[3Fe-4S]クラスターのプロトネーションが電子移動に対して速度を制限していることが報告されている2)。電極とフェレドキシンとの電子移動を調べた結果、フェレドキシンが電子受容に要する時間は、約1 msであるが、電子供与するには約30 ms必要とすることが明らかにされている。

このような電子を保持するメカニズムは本当にあるのであろうか。これを調べるためには、タンパク質の分子間電子移動と分子間の複合体形成を直接測定し、明らかにする必要がある。

3-2　高感度EQCMによるシトクロムc3の電子プール機構の解明
シトクロムc3は分子内にヘム4個を有するタンパク質である。硫酸還元菌由来のシトクロムc3の立体構造を図2に示す。生体内では、電子伝達体として働き、複数の電子を受け渡しする。典型的な例では、硫酸還元菌において、酵素ヒドロゲナーゼが水素の酸化反応を触媒するとき (H2 → 2H+ + 2e-)、2電子を同時に受け取ると考えられている。

シトクロムc3の電子移動のメカニズムとして、電子プール機構の存在が示された。電子プール機構とは、シトクロムc3が4電子受容すると、この4電子を保持したま ま、一定時間電子供与しない機構である9)。先に述べたフェレドキシンの場合とほぼ同様であるが、複数の電子を貯蔵する特徴により、電子プールと呼ばれる。

電子プール機構は、高感度EQCM測定により明らかにされた。図3に示すように、電極上に固定化された電子伝達体とシトクロムc3との分子間電子移動反応系を構築し、酸化還元と同時に進行する複合体形成をモニターする。測定の概略を図3の矢印にしたがって説明する。

最初に、図3の�@にあるような酸化型の固定化分子と酸化型のシトクロムc3との静電的な複合体を形成させる。ここで、電極電位を下げると、固定化分子が還元型となり、酸化型シトクロムc3への電子移動が始まる。このとき、まず、電子移動複合体が形成され (�A)、次に、電子移動が進行する。電子移動複合体では2分子が接近するため、静電的複合体の場合よりも振動数が減少すると予想される。つまり、シトクロムc3が電極に近づくので、振動数が減少する。電子移動が進行すると、�Bにあるように、還元型シトクロムc3と固定化分子との静電的複合体になる。次に、再び固定化分子を酸化型に戻し、還元型シトクロムc3から固定化分子への電子移動を引き起こす。このとき、還元型シトクロムc3が電子を保持するならば、電子移動複合体�Cの形成速度が遅くなる。以上の方法で、電子移動と複合体形成との関係を調べることができる。固定化分子には、メチルビオローゲン誘導体を利用した。メチルビオローゲン誘導体は、シトクロムc3の生体内でのパートナーではないがシトクロムc3と電子移動可能な酸化還元電位を有し、実際に電子授受ができる11)。電子プール機構は、「正しい相手を選択するまで電子を保持する」メカニズムであるから、これを測定するには、シトクロムc3にとって「正しくない相手」を電子移動パートナーに用いなくてはならない。したがって、人工の酸化還元物質であるビオローゲン類が適している。

図4に構築した電極の表面とサイクリックボルタモグラムの結果を示す。図4 (a) にあるように、電極上にピリジン単分子層を構築し、その上に炭素数6のメチレン鎖を介してビオローゲンを固定化した。ビオローゲンの固定化分子数は1.3 x10-11 mol cm-2である。これはサイクリックボルタモグラムから算出した (図4 (b) 破線)。次にこのビオローゲン表面にシトクロムc3を静電的に結合させ、シトクロムc3の単分子層を構築した。静電的に結合したシトクロムc3の分子数7.4 x10-13 mol cm-2は水晶振動子の振動数から算出した。この値から見積もると、隣り合うシトクロムc3の距離は40 nmもあり、シトクロムc3同士が触れ合う事はほとんどない。したがって、この条件では、ビオローゲンとの相互作用のみがシトクロムc3の動きの駆動力になる。

図4 (b) のサイクリックボルタモグラムからシトクロムc3の酸化還元に関与する電子数を算出すると、4 x10-12 mol cm-2であり、シトクロムc3の4〜5倍に相当する。したがって、シトクロムc3内の4つのヘム全てが酸化還元している。また、算出した電子数はサイクリックボルタモグラムの掃引速度に依存していないことから、これらの解釈が正しいことがわかる。

この電極と高感度EQCM測定により電子プール機構を捉えることができる。電極電位をステップさせ、そのときの振動数変化を同時に測定した (図5)。電極電位は-0.3 Vから-0.6 V (vs.Ag/AgCl) にステップさせ、固定化されたビオローゲンを酸化還元させる。固定化されたビオローゲンは-0.3 Vにおいて酸化状態、-0.6 Vでは還元状態である。

時間0秒において、-0.3 Vから-0.6 Vへの電位ステップを行うと、還元型ビオローゲンからシトクロムc3への電子移動過程、すなわち、シトクロムc3の電子受容の様子を知ることができる。このときの振動数変化を見ると、振動数が素早く減少し、およそ0.5 sで一定値になった。この結果から、電子受容の際には、すぐさま電子移動複合体を形成し電子移動が完了しているといえる。したがって、酸化型のシトクロムc3は容易に電子を受け取ることができるといえる。

次に、時間5秒において、-0.6 Vだった電極電位を-0.3 Vに変化させた。ここでは、還元型シトクロムc3からビオローゲンへの電子移動、つまり、シトクロムc3の電子供与のメカニズムを知ることができる。振動数は、上昇した後、ゆっくりと減衰し一定値になる傾向を示した。この減衰過程が電子プール機構の存在を明確に表している。電位が-0.6 Vになった瞬間の振動数の上昇から、還元型シトクロムc3と酸化型ビオローゲンが反発していることが分かる。すなわち、電子移動複合体は形成されず、還元型シトクロムc3は電子を供与していない (図5下の模式図参照)。この状態が電子プール状態である。

固定化されたビオローゲンの分子数はシトクロムc3の約20倍であり、また、酸化還元電位から考えても、容易に電子移動できる。それにも関わらず、複合体の形成が極端に遅いことから、還元型シトクロムc3はビオローゲンを認識していないことがわかる。

図5の減衰曲線から算出した速度定数は0.4 s-1であるから、電子プール状態の寿命は2.5 sである。一般に、タンパク質間の電子移動反応は、遅くとも速度定数にして100 s-1の反応であるから、電子プール状態の寿命は相手を認識するに十分な時間である。電子プール状態を経由することによって、正しい相手を認識し、電子移動が進行しているといえる。これが、秩序ある電子移動を支えるメカニズムの一つである。

3-3　酵素ヒドロゲナーゼと基質シトクロムc3との反応
酵素ヒドロゲナーゼは、プロトンの還元および水素の酸化を触媒する酵素である。硫酸還元菌内では、電子伝達タンパク質シトクロムc3と電子授受を行っている。シトクロムc3は分子内にヘムを4個有するタンパク質である。プロトンの還元反応においては、還元型のシトクロムc3からヒドロゲナーゼへ電子移動が進行し、一方、水素の酸化反応では、ヒドロゲナーゼから酸化型シトクロムc3への電子移動が進行する。これらの触媒反応において、分子間の電子伝達のメカニズムを解明するために行ったEQCM測定例を示す。

まず、シトクロムc3固定化電極を調製し、シトクロムc3の酸化還元を電極でコントロールする。図6に固定化シトクロムc3の概念図を示す。末端にアジド基を持つヘキサンチオールを用いて金表面上に単分子層を構築した。シトクロムc3のN末端にはアルキンを側鎖に有する非天然アミノ酸を導入してあり、電極上のアジドとクリック反応で結合させた10)。この結果、シトクロムc3のヘム１が電極側、ヘム4が溶液側に位置する向きで固定化されたことがわかる。

図7にこのシトクロムc3固定化電極のサイクリックボルタモグラムを示す。電極電位は飽和カロメル電極 (SCE) に対して表記した。得られたボルタモグラムには、酸化ピークおよび還元ピークが見られ、固定化したシトクロムc3が酸化還元していることがわかる。また、ボルタモグラムの酸化ピークおよび還元ピークから、単位面積当たりの固定化分子数を算出した結果、隣り合うシトクロムc3同士の距離は30 nmであることがわかった。

シトクロムc3と酵素ヒドロゲナーゼとの反応をEQCMで測定するために、シトクロムc3固定化電極上に酵素ヒドロゲナーゼの分子層を構築した。シトクロムc3固定化電極と接触している緩衝液に、ヒドロゲナーゼ溶液を加えると、静電的な結合により、シトクロムc3上にヒドロゲナーゼの分子層が構築される。静電的に結合したヒドロゲナーゼの分子数から算出すると、ほぼ1対1の複合体が形成される。

EQCM測定では、この静電的な複合体がシトクロムc3の酸化還元によって変化する様子を測定できる。つまり、静電的複合体内部での酵素ヒドロゲナーゼの動きを知ることができる。

図8はEQCM測定の結果である。15秒おきに電極電位を変化させ、それと同時に起こる振動数の変動を記録した。電極電位は、-0.6 V (vs.SCE) から-0.3 V (vs.SCE) の間で変化させ、それぞれ、15秒間電位を保った。-0.3 Vから-0.6 Vに変化させた場合、固定化されたシトクロムc3は酸化型から還元型になる。したがって、シトクロムc3からヒドロゲナーゼへの電子移動が進行する (水素発生複合体の形成)。一方、-0.6 Vから-0.3 Vに電位を変化させた場合、固定化されたシトクロムc3は酸化型へと変化する。したがって、ヒドロゲナーゼからシトクロムc3への電子移動が進行する (水素吸収複合体の形成)。図8の概念図にあるように、シトクロムc3の酸化還元状態により、ヒドロゲナーゼと結合する位置が変わると考えられる。したがって、電位のコントロールにより、水素発生複合体形成と水素吸収複合体形成をそれぞれ独立に観測することができる。言い換えると、それぞれの複合体形成反応の駆動力を独立に与えていると表現できる。これが溶液中の反応速度論的解析と異なる部分であり、また、エントロピー変化に依存した結合反応をそのまま観測できるというEQCM測定の利点であるといえる。

図8において、-0.3 Vから-0.6 Vに変化させた場合を見ると、振動数が上昇し、その後一定値になっていることがわかる。この1 Hz以内のごくわずかな振動数の上昇から、ヒドロゲナーゼが電極から遠ざかったことがわかる。ヒドロゲナーゼはシトクロムc3と静電的複合体を形成しているので、この振動数変化は複合体内部でのヒドロゲナーゼの動きである。したがって、固定化したシトクロムc3とヒドロゲナーゼは電極から遠い位置で複合体を形成していることがわかる。また、振動数変化の曲線から複合体形成速度定数は0.4 s-1であった。一方、-0.6 Vから-0.3 Vに変化させた場合を見ると、振動数が減少していることがわかる。これは、ヒドロゲナーゼが電極近傍に近づいてきたことを示しており、概念図にあるように、複合体形成は電極に近い位置で行われているとわかる。

固定化シトクロムc3の配向から、溶液側はヘム4、電極側はヘム1である。したがって、EQCM測定の結果から、水素発生反応の場合は、ヘム4近傍で複合体を形成し、水素吸収の場合はヘム1近傍で複合体を形成していることがわかる。以上のように、高感度EQCM測定により、電子移動を伴う酵素反応を分子レベルで解析することができる。

４．おわりに
酵素の機能を解明する上で、応用的な電気化学測定は有用な方法である。しかしながら、低分子の反応解析に利用できた方法が酵素反応の測定に利用できない場合も多い。今回紹介した電気化学複合測定であるEQCM測定は、高感度化に成功し、タンパク質、酵素の測定に利用できた。今後、様々なタンパク質、酵素の反応解析を行うことにより、酵素の電子移動反応の解明が進むと考えられる。

文献
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